Окрашивание (гистология)
Изучение неокрашенного образца под микроскопом — довольно трудная задача, поскольку различные структуры ткани почти одинаково преломляют свет, поэтому гистологический препарат должен быть окрашен специально подобранными красителями, которые избирательно красят соответствующие клетки, ядра и структуры[1]. Целью окрашивания является более отчетливое выделение различных клеток и тканей[2].
Когда были изобретены первые световые микроскопы, исследователям пришлось научиться окрашивать образцы чтобы наблюдать их морфологические особенности. Развитие текстильной промышленности в XIX веке и возросшая необходимость покраски одежды привело к появлению большого разнообразия красителей и пигментов. Многие из этих веществ использовались в гистологии с середины XIX по наши дни. За это время гистологическое окрашивание претерпело огромное развитие благодаря новым методам и синтетическим красителям, которые удовлетворяют большую часть потребностей исследователей[3].
Перед тем как приступить к непосредственно окрашиванию образец подвергают предварительной обработке. Так как красители плохо проникают в парафиновые ткани, необходимо провести депарафинизацию. Она проводится в орто-ксилоле, далее следует регидратация в спиртах нисходящей крепости (от 100 % до 70 %), затем материал помещают в дистиллированную воду[4]. Это в первую очередь касается парафиновых срезов, для замороженных депарафинизация не требуется. После вышеуказанной подготовки срезы могут быть окрашены практически любым красителем.
Основные виды гистологического окрашивания:
- Простые гистологические окрашивания — наиболее традиционные методы, в основе которых лежат физико-химические процессы, не селективные к конкретным химическим компонентам образца, но селективные к структурам клеток[5].
- Гистохимические окрашивания - основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом образца ткани.
- Иммуногистологические окрашивания - нанесение полученных искусственным путем антител против известного белка на гистологический срез и детектирование сформировавшихся иммунных комплексов «антиген-антитело»[5].
Для простых гистологических окрасок выделяют три группы красителей:
- Основные — основания и их соли, окрашивающие клеточные структуры кислой природы (ядрышко, хроматин ядер) и называются базофильными (гематоксилин, тионин, метиловый зеленый, кармин)[2][4].
- Нейтральные — метиленовый синий, судан III, орсеин, осмиевая кислота[2][4].
- Кислые — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляются основные структуры (цитоплазма, эритроциты) и называются оксифильными. Таковыми являются эозин, эритрозин, кислый фуксин, пикриновая кислота, индигокармин[2][4].
Процесс окраски условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный.
- Прогрессивный — процесс идет до достижения интенсивного проникновения красителя в ткань. Срез помещают в слабый раствор красителя и окрашивают довольно продолжительное время, процесс идет до достижения интенсивного проникновения красителя в ткань[2][6].
- Регрессивный — препарат заведомо перекрашивают в концентрированном красителе, а затем удаляют его избыток путем дифференциации — отмывании образца в соответствующем растворителе до нужного уровня[2][6].
По действию красителя на ткани различают[5][4]:
- Прямое окрашивание — если раствор красителя непосредственно действует на ткани.
- Непрямое окрашивание — требуется предварительная обработка образцов специальными протравными красителями.
По количеству красителей[5] :
- Простое — окрашивание одним красителем.
- Сложное — использование нескольких красителей.
По области окрашивания разделяют[4]:
- Обзорные красители — для получения общего представления об образце (окрашиваются цитоплазма, ядра).
- Специальные красители — окрашиваются именно те структуры и ткани, которые интересуют исследователя.
В современной микроскопии используют более 3500 видов красителей, в каждой лаборатории как правило применяют несколько видов окрашивания[4].
Основные методы окрашивания[править | править код]
Окраска гематоксилином и эозином[править | править код]
Окраска гематоксилин-эозином — один из наиболее распространённых методов окрашивания. Он позволяет установить отношения между частями органов, хорошо выявляя все клеточные структуры. Эта окраска является сложной: гематоксилин как основной краситель окрашивает ядра, эозин — кислый краситель — красит протоплазму клеток и различные неклеточные структуры[2].
Гематоксилин — краситель, получаемый из эфирного экстракта кампешевого дерева. Сам по себе не является красящим веществом, поэтому чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению, в результате чего он превращается в красящее вещество — гематеин. Соединяясь с некоторыми солями, гематеин дает хорошее окрашивание ядер (гематоксилин Эрлиха, Майера, железный гематоксилин Гейденгайна)[2].
Эозин — искусственный протоплазматический краситель.
В результате окрашивания гематоксилин-эозином получаются синие ядра, розовые цитоплазма и межклеточное вещество[2].
Окраска железным гематоксилином по Гейденгайну[править | править код]
Используется главным образом для выявления ядерных структур, хотя железный гематоксилин окрашивает и цитоплазму, но значительно слабее. Окраска гематоксилином Гейденгайна требует предварительной протравы и последующей дифференцировки. В качестве протравы используют 4 % водный раствор железоаммиачных квасцов.
Результат окраски — отчетливое и контрастное изображение таких структур как ядрышки, хроматин, митохондрии, клеточные гранулы[7], хорошо выявляются границы клеток и мышечные волокна.
Окраска по Ван Гизону[править | править код]
Данная методика используется для изучения структуры соединительной ткани и выявления коллагеновых волокон[4] и степени фиброза. Краситель — смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина. Коллагеновые волокна окрашиваются в ярко-красный цвет, а мышечные и эластические структуры — в буровато-жёлтый или жёлто-зелёный цвет, ядра становятся чёрными и тёмно-бурыми[8].
Окраска по Массону[править | править код]
Окрашивание трихромом Массона представляет собой сочетание трёх красителей:
- Фиолетовое ядерное окрашивание (гематоксилин).
- Красная окраска цитоплазмы (смесь ксилидина пунцового и фуксиновой кислоты).
- Окраска коллагеновых волокон: анилиновый синий.
В результате ядра окрашиваются в темно-синий или черный цвет, цитоплазма — в розовый или красный, коллагеновые волокна — в синий, а фибрин, мышечные волокна и эритроциты — в красный[9].
Окраска по методу Маллори[править | править код]
Краситель является трёхцветным — в этом методе применяются 3 различных красителя: карболфуксин для окрашивания ядер, оранжевый G для цитоплазмы и анилиновый синий для избирательного окрашивания коллагена.
Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет, многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) — в красный или оранжевый цвет, миелиновые волокна — в жёлтый[1].
Импрегнация серебром
Импрегнация серебром по методу Гольджи выявляет нейроны и детали их функционирования.
Метод основан на способности различных волокнистых структур соединительной ткани восстанавливать и осаждать ионы серебра. Восстановление (редукция) металлического серебра приводит его осаждению на элементах нервной системы, которые приобретают черный или коричневый цвет[10]
Гистохимические методы окрашивания[править | править код]
Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата, помогают установить локализацию определенных химических веществ и продуктов их метаболизма в тканях и клетках
ШИК-реакция (PAS или реакция Шифф-йодной кислотой)[править | править код]
Используется для определения содержания полисахаридов ( гликогена) в таких тканях, как печень, сердце и скелетные мышцы, на срезах тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином, а также может использоваться для замороженных срезов[11].
В целом метод предназначен для окрашивания структур, содержащих высокую долю углеводных макромолекул ( гликоген , гликопротеин ), которые обычно встречаются в соединительных тканях, слизи. Основной реагент - реактив Шиффа, взаимодействующий со свободными альдегидными группами. ШИК-положительные вещества окрашиваются в красный цвет различных оттенков. Нейтральные мукополисахариды становятся пурпурно-красными, гликоген окрашивается в темно-красный цвет.
Окраска тулоидиновым синим[править | править код]
Тулоидиновый синий используется для обнаружения тучных клеток в препаратах. Метод основан на взаимодействии тулоидинового синего с гепарином, находящимся в гранулах тучных клеток. При этом наблюдается метахроматическое окрашивание гранул (метахромазия - свойство красителя окрашивать различные ткани и клетки в цвет, отличный от цвета самого красителя)[12].
Примечания[править | править код]
- ↑ 1 2 Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.Н., Артемьев В.Н. Гистологическая техника: учебное пособие. — 3-е изд. — Омск-Орёл: Омская областная типография, 2006. — 290 с. — ISBN 5-87367-025-0.
- ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 И.Ю. Домницкий, В.В. Салаутин, А.А. Терентьев. Секционный курс и методы патогистологических исследований: метод. пособие по выполнению лабораторных работ для студентов по специальности 36.05.01 Ветеринария. — Саратов: ФГБОУ ВО «Саратовский ГАУ», 2017. — 50 с.
- ↑ Atlas of Plant and Animal Histology. Departamento de Bioloxía Funcional e Ciencias da Saúde (англ.). Universidad de Vigo.
- ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 В. А. Корьяк, Л. А. Николаева. Основы гистологической техники : учебное пособие. — Иркутск: ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, Институт сестринского образования, 2020. — 85 с. — ISBN 53.45я723.
- ↑ 1 2 3 4 Мавликеев М.О., Архипова С.С., Чернова О.Н., Титова А.А., Певнев Г.О., Шафигуллина А.К., Киясов А.П. Краткий курс гистологической техники. Учебно-методическое пособие / под научной редакцией кандидата медицинских наук, доцента Р.В. Деева. — Казань: Казан. у-нт, 2020. — 107 с. — ISBN УДК 57.086.1, ББК 28с.
- ↑ 1 2 Бетехтина А.А., Уткина И.А. Микротехнические исследования на базе современного оборудования. Руководство к практическим занятиям. — Уральский государственный университет, 2008. — 110 с.
- ↑ Янин В.Л., Бондаренко О.М., Сазонова Н.А. Учебно-методическое пособие для аспирантов заочной формы обучения к практическим занятиям по дисциплине «Методы исследования в цитологии и гистологии». — Ханты-Мансийск: БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», 2015. — 65 с. — ISBN БКК 28.706.
- ↑ О. В. Волкова, Ю. К. Елецкий. Основы гистологии с гистологической техникой : учебник для медицинских училищ. — 2-е изд. — М.: Медицина, 1982. — 304 с.
- ↑ Masson trichrome - Histalim. Дата обращения: 22 сентября 2015. Архивировано из оригинала 2 сентября 2018 года.
- ↑ Большая Медицинская Энциклопедия / под редакцией Петровского Б.В.. — 3-е издание.
- ↑ PAS (Periodic Acid Schiff) Staining Protocol. University of Rochester Medical center.
- ↑ Гистохимические окраски, применяемые в патоморфологических исследованиях. Интерактивный атлас для студентов младших курсов медицинских вузов.