PBR322
pBR322 — плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. Создана в 1977 году мексиканскими биологами Франциско Боливаром[англ.] и Раймондом Родригесом[1].
pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару[2] и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1[англ.]); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124[англ.]) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101[англ.]). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта (HindIII[англ.] и ClaI[англ.]) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori[англ.], заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1[3]. Он кодирует две РНК (RNAI и RNAII) и один белок (Rom или Rop).
Молекулярная масса плазмиды составляет 2,83⋅106 дальтон[4].
Код в базе данных GenBank — J01749[5].
Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза (англ. penicillin beta-lactamase) с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину[5].
История создания[править | править код]
В 1975 году, когда Франциско Боливар[англ.] начал работу в Калифорнийском университете в Сан-Франциско в составе группы Герберта Бойера, инструментарий, имевшийся в распоряжении молекулярных биологов, был крайне беден. Векторы клонирования имели очень большую молекулярную массу, их свойства были плохо изучены, удобные сайты клонирования отсутствовали[6].
Группа Бойера, в состав которой входило несколько талантливых биологов, занималась клонированием и изучением некоторых специфических генов. Однако работа продвигалась крайне медленно из-за отсутствия удобных инструментов, в первую очередь векторов клонирования, а также достаточно чистых эндонуклеаз рестрикции и ДНК-лигазы Т4. Со временем некоторые члены группы пришли к мысли о создании более совершенного инструментария.
В первое время Бойер не одобрял занятий своих сослуживцев, и большую часть работы пришлось проделать в нерабочее время. Однако когда плазмида pBR322 была создана, он стал активным сторонником и пропагандистом нового инструмента, заменив им использовавшуюся ранее плазмиду pMB9. Новая плазмида быстро распространилась по научному сообществу, в течение первых дней её получили более 300 лабораторий по всему миру. Оригинальный метод клонирования путём деактивации генов сопротивляемости к антибиотикам позволял легко планировать эксперименты и быстро анализировать полученные данные.
В то время проблемы биологической безопасности считалась чрезвычайно актуальными, поэтому плазмида была создана с сильно ограниченными возможностями распространения за пределами лаборатории. Она стала первым вектором типа EK2, сертифицированная Национальным институтом здоровья[англ.] как соответствующая требованиям безопасности для рекомбинантных ДНК.
Наконец, очень сильно способствовало популярности новой плазмиды расшифровка и опубликование в 1979 году её нуклеотидной последовательности, сделанное Грегом Сатклиффом (англ. Greg Sutcliffe) из лаборатории Уолтера Гилберта[7].
В течение десятилетий pBR322 активно использовалась в генных исследованиях. Её кодовая последовательность и функции генов были настолько хорошо изучены, что стали использоваться как компоненты при создании новых инструментальных плазмид.
Оригинальная статья в журнале Gene[1], где было описано создание плазмиды, стала одним из лидеров по числу цитирований среди статей по молекулярной биологии в 1970-х и начале 1980-х годов[8].
Структура плазмиды[править | править код]
Нуклеотидная последовательность[править | править код]
Нуклеотидная последовательность pBR322 следующая[5]
pBR322
1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA
61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG
121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT
181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA
241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG
301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC
361 CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC
421 AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCGCCA
481 CTTCGGGCTC ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG
541 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC TCAACGGCCT
601 CAACCTACTA CTGGGCTGCT TCCTAATGCA GGAGTCGCAT AAGGGAGAGC GTCGACCGAT
661 GCCCTTGAGA GCCTTCAACC CAGTCAGCTC CTTCCGGTGG GCGCGGGGCA TGACTATCGT
721 CGCCGCACTT ATGACTGTCT TCTTTATCAT GCAACTCGTA GGACAGGTGC CGGCAGCGCT
781 CTGGGTCATT TTCGGCGAGG ACCGCTTTCG CTGGAGCGCG ACGATGATCG GCCTGTCGCT
841 TGCGGTATTC GGAATCTTGC ACGCCCTCGC TCAAGCCTTC GTCACTGGTC CCGCCACCAA
901 ACGTTTCGGC GAGAAGCAGG CCATTATCGC CGGCATGGCG GCCGACGCGC TGGGCTACGT
961 CTTGCTGGCG TTCGCGACGC GAGGCTGGAT GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC
1021 CGGCGGCATC GGGATGCCCG CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA
1081 TCAGGGACAG CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCACTGGACC
1141 GCTGATCGTC ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT TGGCATGGAT
1201 TGTAGGCGCC GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG CGTCGCGGTG CATGGAGCCG
1261 GGCCACCTCG ACCTGAATGG AAGCCGGCGG CACCTCGCTA ACGGATTCAC CACTCCAAGA
1321 ATTGGAGCCA ATCAATTCTT GCGGAGAACT GTGAATGCGC AAACCAACCC TTGGCAGAAC
1381 ATATCCATCG CGTCCGCCAT CTCCAGCAGC CGCACGCGGC GCATCTCGGG CAGCGTTGGG
1441 TCCTGGCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG
1501 GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC
1561 TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG
1621 TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA
1681 GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA
1741 CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA
1801 CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT
1861 TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC
1921 AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT
1981 CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC
2041 GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC
2101 CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC
2161 AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC
2221 CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG
2281 TACTGAGAGT GCACCATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC
2341 GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC
2401 GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA
2461 ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG
2521 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT
2581 CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA
2641 GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC
2701 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT
2761 AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG
2821 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG
2881 CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT
2941 TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC
3001 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG
3061 CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC
3121 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT
3181 AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA
3241 AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT
3301 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT
3361 GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG
3421 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG
3481 CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA
3541 ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG
3601 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG
3661 GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT
3721 CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA
3781 TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG
3841 GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC
3901 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG
3961 GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA
4021 TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG
4081 GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT
4141 GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC
4201 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA
4261 CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT
4321 ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA A
|
|---|
Гены[править | править код]
Источник информации[9].
| Ген | Нуклеотидная последовательность |
Источник | Примечание |
|---|---|---|---|
| tet (TcR) | 86—1276 | pSC101 | Устойчивость к тетрациклину |
| bla (ApR) | 4153—3293 | Tn3 | Устойчивость к ампициллину |
| rop | 1915—2106 | pMB1 | Белок Rop |
| ori | 3122—2534 | pMB1 | Участок репликации |
Сайты рестрикции[править | править код]
Жирным шрифтом выделены уникальные сайты[9].
| По координатам | По алфавиту | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Сайт | Координата | Ген | Сайт | Координата | Ген |
| ClaI-BspDI | 23 | AatII-ZraI | 4284 | ||
| HindIII | 29 | AcuI | 3000 | ori | |
| EcoRV | 185 | tet | AcuI | 4048 | amp |
| BmtI-NheI | 229 | tet | AhdI | 3361 | amp |
| BamHI | 375 | tet | AlwNI | 2884 | ori |
| SgrAI | 409 | tet | AseI | 3537 | amp |
| BanII | 471 | tet | AvaI-BsoBI | 1425 | |
| BanII | 485 | tet | BamHI | 375 | tet |
| BtgI | 528 | tet | BanII | 471 | tet |
| SphI | 562 | tet | BanII | 485 | tet |
| EcoNI | 622 | tet | BciVI | 2682 | ori |
| SalI-AccI-HincII | 651 | tet | BciVI | 4209 | |
| PshAI | 712 | tet | BmtI-NheI | 229 | tet |
| EagI | 939 | tet | BsaAI | 2225 | |
| BseYI | 949 | tet | BsaBI | 1668 | |
| NruI | 972 | tet | BsaI | 3433 | amp |
| BstAPI | 1045 | tet | BseYI | 949 | tet |
| BspMI-BfuAI | 1063 | tet | BseYI | 2777 | ori |
| PflMI | 1315 | BsgI | 1650 | ||
| BsmI | 1353 | BsmBI | 2122 | ||
| PflMI | 1364 | BsmI | 1353 | ||
| StyI | 1369 | BspEI | 1664 | ||
| AvaI-BsoBI | 1425 | BspMI-BfuAI | 1063 | tet | |
| PpuMI | 1438 | BspQI-SapI | 2350 | ||
| MscI | 1444 | BsrBI | 2404 | ||
| BtgI | 1447 | BsrBI | 4205 | ||
| PpuMI | 1480 | BsrDI | 3420 | amp | |
| BsgI | 1650 | BsrDI | 3602 | amp | |
| BspEI | 1664 | BstAPI | 1045 | tet | |
| BsaBI | 1668 | BstAPI | 2291 | ||
| XmnI | 2029 | rop | BstZ17I-AccI | 2244 | |
| PvuII | 2064 | rop | BtgI | 528 | tet |
| BsmBI | 2122 | BtgI | 1447 | ||
| DrdI | 2162 | BtsI | 3759 | amp | |
| Tth111I-PflFI | 2217 | BtsI | 3787 | amp | |
| BsaAI | 2225 | ClaI-BspDI | 23 | ||
| BstZ17I-AccI | 2244 | DrdI | 2162 | ||
| BstAPI | 2291 | DrdI | 2575 | ori | |
| NdeI | 2295 | EagI | 939 | tet | |
| BspQI-SapI | 2350 | EarI | 2351 | ||
| EarI | 2351 | EarI | 4155 | ||
| BsrBI | 2404 | EcoNI | 622 | tet | |
| PciI-AflIII | 2473 | EcoRI | 4359 | ||
| DrdI | 2575 | ori | EcoRV | 185 | tet |
| BciVI | 2682 | ori | HincII | 3905 | amp |
| BseYI | 2777 | ori | HindIII | 29 | |
| AlwNI | 2884 | ori | MscI | 1444 | |
| AcuI | 3000 | ori | NdeI | 2295 | |
| AhdI | 3361 | amp | NruI | 972 | tet |
| BsrDI | 3420 | amp | PciI-AflIII | 2473 | |
| BsaI | 3433 | amp | PflMI | 1315 | |
| AseI | 3537 | amp | PflMI | 1364 | |
| BsrDI | 3602 | amp | PpuMI | 1438 | |
| PstI | 3607 | amp | PpuMI | 1480 | |
| PvuI | 3733 | amp | PshAI | 712 | tet |
| BtsI | 3759 | amp | PstI | 3607 | amp |
| BtsI | 3787 | amp | PvuI | 3733 | amp |
| ScaI | 3844 | amp | PvuII | 2064 | rop |
| HincII | 3905 | amp | SalI-AccI-HincII | 651 | tet |
| XmnI | 3961 | amp | ScaI | 3844 | amp |
| AcuI | 4048 | amp | SgrAI | 409 | tet |
| EarI | 4155 | SphI | 562 | tet | |
| SspI | 4168 | SspI | 4168 | ||
| BsrBI | 4205 | StyI | 1369 | ||
| BciVI | 4209 | Tth111I-PflFI | 2217 | ||
| AatII-ZraI | 4284 | XmnI | 2029 | rop | |
| EcoRI | 4359 | XmnI | 3961 | amp | |
Плазмида pBR322 в массовой культуре[править | править код]
По сюжету романа Майкла Крайтона «Парк юрского периода» части плазмиды pBR322 используются для воссоздания ДНК динозавров[10]. Хотя само название плазмиды не упоминается на страницах книги, там приводится последовательность нуклеотидов, являющаяся по сюжету фрагментом восстановленной ДНК динозавра. Поиск в базе данных GenBank при помощи поисковой программы BLASTN находит большое количество совпадений с генной последовательностью pBR322.
См. также[править | править код]
Ссылки[править | править код]
- Overview
- ETHZ/Biology/Lab
- Restriction Maps. pBR322.
- Bacterial Vectors >> pBR 322 Plasmids.
- J. Gregor Sutcliffe. The Sequence of pBR322 (неопр.) // Current Contents. — December 17, 1990. — Т. 51. — С. 22.
Примечания[править | править код]
- ↑ 1 2 Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system (англ.) // Gene[англ.] : journal. — Elsevier, 1977. — Vol. 2, no. 2. — P. 95—113. — PMID 344137. Архивировано 9 апреля 2018 года.
- ↑ Watson, N. A new revision of the sequence of plasmid pBR322 (англ.) // Gene[англ.]. — Elsevier, 1988. — Vol. 70, no. 2. — P. 399—403. — doi:10.1016/0378-1119(88)90212-0. — PMID 3063608.
- ↑ Qiagen Plasmid Resource Center. Growth of Bacterial Cultures. Архивировано 16 октября 2005 года.
- ↑ pBR322 Vector Архивировано 13 октября 2010 года..
- ↑ 1 2 3 pBR322 Nucleotide Sequences, NCBI Sequence Viewer v2.0.
- ↑ Все материалы данного раздела, кроме абзацев, где источник указан особо, взяты из статьи Francisco Bolivar Zapata. Multipurpose Tools in Molecular Biology (неопр.) // Current Contents. — November 19, 1990. — Т. 47. — С. 12. Архивировано 7 июня 2013 года.
- ↑ Sutcliffe J. G. (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322 Архивная копия от 28 мая 2016 на Wayback Machine. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77—80, PMID 383387.
- ↑ Garfield E. (1 October 1984) The articles most cited in 1961-1982. 4. 100 additional Citation Classics Архивная копия от 28 июня 2010 на Wayback Machine. Current Contents, 40: 3—9.
- ↑ 1 2 Restriction Maps. pBR322 Архивировано 26 июня 2011 года..
- ↑ Mark Boguski. A Molecular Biologist Visits Jurassic Park (англ.) // Biotechniques[англ.] : journal. — 1992. — Vol. 12. — P. 668—669. Архивировано 20 ноября 2008 года.